O neuroblastoma de alto risco, uma das principais causas de mortalidade por câncer pediátrico, apresenta substancial heterogeneidade intratumoral, contribuindo para a resistência terapêutica. Para entender a evolução do microambiente tumoral durante a terapia, perfilamos longitudinalmente 22 pacientes com neuroblastoma de alto risco antes e depois da quimioterapia de indução usando RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e sequenciamento do genoma completo. Isso revelou mudanças profundas nas subpopulações de células tumorais e imunes após a terapia e identificou reguladores transcricionais acionados por potenciadores dos estados neoplásicos do neuroblastoma. O mau resultado se correlacionou com estados neoplásicos proliferativos e metabolicamente ativos, enquanto estados semelhantes aos neurônios mais diferenciados previram um melhor prognóstico. As proporções de células neoplásicas mesenquimais aumentaram após a terapia e uma alta proporção se correlacionou com uma pior resposta quimioterápica. Os macrófagos se expandem significativamente para fenótipos pró-angiogênicos, imunossupressores e metabólicos. Identificamos redes de sinalização parácrina e validamos o eixo HB-EGF-ERBB4 entre subconjuntos de macrófagos e neoplásicos, o que promoveu o crescimento tumoral por meio da indução da sinalização ERK. Essas descobertas revelam coletivamente reguladores intrínsecos e extrínsecos da resposta à terapia no neuroblastoma de alto risco.